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时间:2020-06-21 07:32  编辑:wendj

小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养

1、取骨髓,对倍稀释

2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜,尽量产生气泡,起到缓冲作用)

3、2000转,离心30分钟

4、吸取白膜层,(沿管壁)交替多次吸取,加入5倍体积以上的PBS液

5、1500转,离心15分钟(洗掉血小板)

6、弃掉上清,留少许回流液,轻弹管壁,加入PBS液至50ml

7、800转,离心10分钟,(洗掉红细胞)

8、重复两至三次

9、加入PBS液至50ml,计数:?个细胞

离心后铺板,1X1076孔板培养液,共铺20板。无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液,洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—

4(500U/lml) ,这时细胞部分悬浮

11、第五天为imDC,+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天,为mDC。

参考Inaba等人的方法,并根据本实验室的经验稍作改进。即:

1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠,无菌状态下取股骨和胫骨,浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液,从骨干的一端刺入骨髓腔,将骨髓冲洗到一无菌培养皿中,每根骨头反复4~6遍,收集培养皿中的骨髓细胞悬液,离心,1500 rpm×10min。

3. 弃去上清,加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞,于室温下静置2分钟溶解红细胞后,再次离心,1500 rpm×5min,弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮,分至6孔培养板中,并在每孔中加入完全培养基至4 ml,再加入rmGM-CSF至终浓度

10 ng/ml,IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃,含5% CO2的孵箱中培养48小时。

6. 轻轻吹打细胞后,连同培养液一起吸去悬浮细胞,仅保留贴壁细胞。

7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF,继续培养至第5天。

8. 半量换液,并补足rmGM-CSF;尽量保留悬浮细胞。

9. 继续培养至第7天,用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞,即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-

derived dendritic cell, BMDC)。经鉴定,此时BMDC的纯度可达80%以上。

楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。我本人没有培养外周血DC的经验,但培养了2年半的小鼠骨髓DC,有稍许体会。其中体会最深的是:强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法,我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位,而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。下面是我用上述方法培养的小鼠DC,供朋友们共同讨论。

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