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幸福的泌尿科1迅雷下载

时间:2020-09-21 01:31  编辑:wendj

酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

蒋冬花1,2,后加衡1,黄大年2,任不凡2,毛建卫3

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004;2.浙江新安化工集团有限公司,浙江杭州 311600;

3.浙江科技学院生物与化学工程系,浙江杭州 310012)

摘 要 从酸菜中筛选到2株相对高产γ-氨基丁酸的乳酸菌(G A BA)菌株,酸菜1号和酸菜3号。酸菜1号初步鉴定为植物乳杆菌(L actobacil lus p lantarum);酸菜3号初步鉴定为乳酸链球菌(S treptococcus lactis)。实验还对酸菜1号菌株的培养基和培养条件进行了优化:用蔗糖为碳源、蛋白胨和牛肉膏作为复合氮源、培养基初始pH为6.0、培养温度为30~34℃时该菌株发酵产G ABA的量最多,发酵过程中的振荡培养(100r/ min)和静置培养对G ABA的产量无明显影响;在最佳培养基组合和发酵条件下,发酵液中G A BA含量可达4g/L以上,表明利用乳酸菌进行富含G ABA食品的生产是可行的。

关键词 γ-氨基丁酸(GA BA);乳酸菌;分离;鉴定

中图分类号 Q939.11+7   文献标识码 A   文章编号 1005-7021(2007)01-0035-05

Screening ofγ-Amino-Butyric-Acid-High-Yielding

Lacto-Bacteria in Pickled Vegetable

JIANG Dong-hua1,2,HO U Jia-heng1,H UANG Da-nian2,REN Bu-fan2,MAO Jian-wei3

(1.Coll.o f Chem.&Li fe S ci.Zejian g Nor mal Univ.J inhua321004;2.X in’an Chem.Ind.Group.

Co.LTD.Hang zhou311600;3.Dept.o f B iochem.En gin.Zejian g Univ.o f S ci.&Technol.Hang z hou310012)

A bstract T wo lacto-bacteria highly yie ldingγ-amino buty ric acid(GA BA)w ere isolated from pickled veg etable (PV),P V1and PV2.P reliminary identification sho wed tha t P V1w as Lactobaci llus plantarum,while PV2 Streptococcus lactis.T he ex pe riment o ptimized the culture medium and conditions fo r PV1to yield the highest G A BA:suc rose a s carbon sour ce,peptone and beef ex tract as complex nitrog en sour ce,initial pH at6.0,tem-perature a t30~34℃.T he co ntent o f G A BA was over4g/L in the optimum culture conditio ns.Thereby,it is fea sible to utilize these lacto-bacteria to prepare G A BA and pro duction of fo od rich in G ABA.

Keywords γ-amino buty ric acid(G A BA);lactic acid bacte ria;isolatio n;ide ntificatio n

  γ-氨基丁酸(γ-amino buty ric acid,GABA)广泛存在于自然界中,是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,主要存在于哺乳动物脑、脊髓中,是一种重要的抑制性神经传递物质。已有研究表明: GABA是一种生理活性成分,具有抗焦虑、抗惊厥、降血压、增加神经营养、改善脑机能、促进长期记忆、促进生长激素分泌、活化肾功能、肝功能等多种生理功能[1,2],有很好的医药应用前景;同时又是一种新型食品活性因子,在功能食品中的应用已成为研究热点[3,4]。近年来,富含GABA的食品开发受到重视,目前也正致力于这方面的研究。

GABA的制备有化学合成法和生物合成法。化学合成法成本较高且安全性差,而生物合成法则是一种低成本的方法。GABA的发酵法制备以往用大肠杆菌作为菌种[5],但是使用大肠杆菌存

 收稿日期:2006-09-06

 作者简介:蒋冬花 女,教授,博士后。主要从事微生物学和植物病理学教学与科研工作。 项目来源:中国博士后(2004036170)和浙江省博士后(2004-bsh-003)科研资助项目35

微生物学杂志 2007年1月第27卷第1期 JO U RN A L O F M ICRO BIO LO G Y Jan.2007Vo l.27N o.1

在安全卫生方面的隐患。近期研究发现:一些高安全的微生物,如曲霉[6,8]、乳酸菌[3,4,9~11]、酵母菌[12]等也具有谷氨酸脱羧酶(Glutam ate Decar-box ylase,简称GAD)活性,可以进行GAD的提取和GABA的生产。本研究从食用级微生物乳酸菌着手,通过菌种选育和发酵条件优化等研究以获得高产GABA的菌株,确定最佳的培养发酵条件,为使用这种食品安全级微生物进行GABA 的生产以及富含GABA的功能性食品的生产提供菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及其来源 本实验选用白菜、酸奶、藕片、佛手果、胡萝卜等为材料,28℃厌氧腌制2d至酸性(pH约4.0),取汁液100μL接入乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿),无菌涂布器涂匀, 32℃培养48h,出现圆形乳白或黄色菌落,周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌。经分离、纯化后移入M RS[13]试管中,将所获菌株编号,置4℃冰箱中保存,备用。

1.1.2 培养基 ①乳酸菌分离培养基(质量分数,%):牛肉膏1,蛋白胨1,酵母膏1,葡萄糖0.5,番茄汁20,吐温0.05,碳酸钙2,琼脂1.5,溴甲酚绿0.01,pH 6.5;②M RS培养基[13](质量分数,%):酪蛋白胨1,牛肉提取物1,酵母提取物0.5,葡萄糖0.5,乙酸钠0.5,吐温-800.1,柠檬酸二胺0.2,磷酸氢二钾0.2,硫酸镁0.02,硫酸锰0.005,琼脂

2.0,pH 6.5;③TYG液体培养基[13](质量分数,%):胰蛋白胨0.5,酵母膏0.5,葡萄糖1.0,丁二酸钠0.5,pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌株的鉴定 ①形态学鉴定:观察、记录分离培养基平板上菌落形态;菌体形态经染色后用显微镜(Leica,德国)于100倍的油镜下观察并拍照[14];②生理生化特性鉴定:革兰氏染色反应、接触酶反应、H2S试验和糖发酵试验等参考文献[14]进行。

1.2.2 菌种活化与传代 用M RS固体柱状培养基进行菌种活化传代;32℃培养24h后置于4℃冰箱中待用,菌株每2周转接1次。

1.2.3 发酵种子培养 从活化的M RS固体斜面培养基上挑取适量菌种接入液体M RS中, 32℃活化培养16h。250m L三角瓶中装入50m L TYG培养液,取培养16h的种子培养液,按0.2%的接种量接种后,32℃静置培养24h 作发酵种子。

1.2.4 发酵培养和产GABA菌株筛选 250mL三角瓶中装入50m L加入质量分数为1%谷氨酸钠的TYG液体培养基,取培养16h 的种子培养液,按3%接种量接种,32℃静置培养24h后,取发酵液分析检测GABA产生情况,进行菌株筛选。

1.2.5 发酵液中GABA的定性、定量测定 用改良纸层析法[13],按0.4%的比例将显色剂茚三酮加入展开剂中,展开剂组成体积比为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶2∶1,取发酵液1000μL于离心管中,煮沸5m in后10000g离心10min,取5μL上清液点样,展开后65℃显色30min,拍照。标准γ-氨基丁酸(Sig ma,纯度99.9%以上)配成5g/L做参比,将显色后的条带剪下,用5mL洗脱剂洗脱,在520nm测吸光度进行初步定量。洗脱剂组成的质量分数比为0.1%硫酸铜∶75%乙醇=2∶38。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与纯化

通过分离、纯化和初步鉴定共获得74株乳酸菌菌株。

2.2 产GABA乳酸菌菌株的初筛

将各菌株接入T YG培养液发酵培养24h,发酵液用改良纸层析法分析检测[13]。测定结果表明(见表1),不同乳酸菌产生GABA的能力存在显著差异,能产生GABA的菌株有酸菜中分离的1~8号、10号、18号、20~27号、32号、35号、36号;酸奶中分离的1号、2号和11号;藕片中分离的2号、佛手果中分离的1号和胡萝卜中分离的1号。

2.3 菌种复筛

对所获产生GABA较明显乳酸菌菌株进行第2次纸层析检测,并用分光光度计进行初步定量,以筛选GABA含量相对较高的菌株。结果GABA含量较高的有酸菜1号、3号、酸奶11号等(图1),GABA含量分别为3.82、3.55和2.34

36         微 生 物 学 杂 志                 27卷

g /L (图2)。下面以酸菜1号和酸菜3号为研究对象进行菌种鉴定。

表1 不同乳酸菌菌株发酵液中GABA 的产生

Table 1 GABA production of lactic acid bacteria

in fermen tation m edium

分离材料酸菜酸奶藕片佛手果胡萝卜测试菌株号

1~36

1~20

1~61~61~6产GABA  1、2、3、4、5、6、7、81、2、112

1

1

菌株号  10、18、20、21、22

23、24、25、26、27

32、35、

36

图1 酸菜1号、3号和酸奶11号培养液中

GABA 产生的层析结果

Fig.1 The GABA production ch rom atographic separations 'result of three selected lactic acid bacteria

加样量:GABA 为1μL ,样品为5μL

The quantity of GABA is 1μL ,and the s pecim en is 5μ

L

图2 酸菜1号、3号、酸奶11号培养液中GABA 含量

Fig.2 The GABA p rodu ctions of three selected lactic acid bacteria in fermen tation m edium

2.4 菌种鉴定

2.4.1 形态特征 ①酸菜1号:菌落较小、圆

形、中间隆起,表面湿润光滑,色泽乳白较暗,边缘不规则。杆状,较细长,长短不一,两头稍平,有的细长弯曲,无芽胞(图3A )。②酸菜3号:菌落较小、圆形、中间隆起,表面湿润光滑,乳白色,边缘整齐,周边有小皱纹。球状,多成对或串连呈长链状,无芽胞(图3B )。

2.4.2 生理生化特征 酸菜1号:革兰氏G +,不液化明胶;吲哚反应阴性,硫化氢试验阴性,接触酶试验阴性。葡萄糖发酵产酸不产气,果糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖等发酵阳性。

根据形态特征和生理生化反应,此菌株可初步鉴定为乳杆菌属,植物乳杆菌(Lactobacillus

p lantarum )[14]

。

酸菜3号:革兰氏G +,不液化明胶;吲哚反应阴性,硫化氢试验阴性,接触酶试验阴性。

根据形态特征和生理生化反应,此菌株可初步鉴定为乳酸链球菌属,乳酸链球菌(S treptococ -cus lactis )[14]。

2.5 培养基和培养条件的优化(酸菜1号)2.5.1 不同碳源对GABA 产量的影响 以T YG 培养基为基础,分别采用葡萄糖、乳糖、可溶

性淀粉、蔗糖、谷氨酸钠作为惟一碳源,考察不同碳源对发酵产生GABA 量的影响。实验结果(表2)表明,蔗糖和谷氨酸钠作为碳源时发酵液中GABA 产量相对较高,其他3种碳源则较低,并且效果基本一致,考虑到使用蔗糖的成本要比谷氨酸钠低,下面实验采用蔗糖作为主要碳源。

表2 不同碳源对发酵液中GABA 产量的影响

T ab le 2 Effects of different carbon sources

on GABA production

碳源蔗糖谷氨酸钠可溶性淀粉乳糖葡萄糖GABA 平均 4.02

3.85

3.22

3.18

3.06

含量/(g L -1)差异显著性

a ,A

a ,A

b ,B

b ,B

b ,B

(0.05,0.01)

 注:差异显著性经Du ncan 氏新复极差法检验,不同小写字母表示在P ≤0.05水平上差异显著,不同大写字母表示在P ≤0.01水平上差异显著,下同

37

1期             蒋冬花等:酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选         

图3 酸菜1号(A)和酸菜3号(B)形态特征(1000×)

Fig.3 The s hapes in micros cope of NO1and NO3from picking vegetable(1000×)

2.5.2 不同氮源对GABA产量的影响 在以蔗糖作为碳源的基础上,分别采用不同的有机氮和无机氮作为惟一氮源进行实验,结果见表3。以无机氮硫酸铵和硝酸钠作为氮源时,GABA生成的量非常少,有机氮则对发酵产GABA的效果较显著,其中又以蛋白胨的效果最好,可以达到无机氮的3~4倍。

表3 不同惟一氮源对发酵液中GABA产量的影响Table3 Effects of differen t nitrogen s ou rces

on GABA production

氮源蛋白胨酵母膏牛肉膏硫酸铵硝酸钠

GABA含 4.05 3.52 2.73 1.16 1.03

量/(g L-1)

差异显著性a,A b,B c,C d,D d,D (0.05,0.01)

  因为蛋白胨对发酵产GABA的效果最好,组成复合氮源时都加入蛋白胨。以蛋白胨分别和酵母膏、牛肉膏、硝酸钠和硫酸铵组成复合氮源。不同复合氮源对发酵产GABA的影响见表4。结果表明使用蛋白胨和牛肉膏作为复合氮源时发酵液中GABA的含量最高,可能是这两种物质含乳酸菌生长所需的各种辅助因子较丰富,并相互补充,激活了GAD酶的活性,从而使发酵液中GA-BA的含量升高。两种有机氮组合比有机氮与无机氮组合效果好。

2.5.3 初始pH对GABA产量的影响 将优化后的培养基即用蔗糖为碳源,以蛋白胨和牛肉膏为复合氮源的培养基,用1mo l/L的NaOH和1mol/L的H Cl溶液调节使初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0,然后接入菌种在32℃进行摇床培养,24h后测定发酵液中GABA的含量,结果表明(表5),培养基初始pH以6.0为宜,此时发酵液中GABA的含量最高。

表4 不同复合氮源对发酵液中GABA产量的影响Table4 Effects of different compound nitrogen

s ou rces on GABA p rodu ction

氮源蛋白胨+蛋白胨+蛋白胨+蛋白胨+

牛肉膏酵母膏硝酸钠硫酸铵GABA含量 4.21 3.56 2.94 2.48

/(g L-1)

差异显著性a,A b,B c,C c,C

(0.05,0.01)

表5 初始pH对发酵液中GABA产量的影响

T ab le5 Effects of original p H on GABA production

pH 6.07.0 5.0 4.0 GABA含量/(g L-1) 4.28 3.36 3.18 2.6

差异显著性(0.05,0.01)a,A b,B b,B c,C

2.5.4 培养温度对GABA产量的影响 将经优化的液体发酵培养基接入菌种,分别在28~ 36℃不同的温度下培养24h测定发酵液中GA-BA的含量。结果显示,当温度为30~34℃时发酵产GABA的量较高,表明在此温度范围内GAD酶活性较高,温度偏高或偏低对酶活性表现都不利。

38         微 生 物 学 杂 志                 27卷

表6 培养温度对GABA产量的影响

T able6 Effects of cultu re temperatu re

on GABA production

培养温度/℃2830323436

GABA含量/(g L-1) 3.75 4.24 4.29 4.12 3.67

差异显著性(0.05,0.01)a,A b,B b,B b,B a,A

2.5.5 振荡培养和静置对GABA产量的影响 将优化后的培养基接入菌种分别进行振荡培养(100r/min)和静置培养。结果表明,振荡培养和静置培养后发酵液中GABA的产量接近,静置培养为4.26g/L,振荡培养为4.29g/L,没有显著差异。可能因为乳酸菌本身是兼性厌氧菌,氧气的多少对发酵产生GABA的量和菌体的生长影响不大。

3 讨 论

  本实验的目的是筛选具有高谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌,发酵制备GABA和开发富含GABA 的食品。通过筛选,从酸菜中获得了2株相对高产GABA的乳酸菌。通过培养基和发酵条件优化,酸菜1号最佳的培养基组合和适宜培养条件为:蔗糖作碳源,蛋白胨和牛肉膏作复合氮源的T YG培养基,初始pH为6.0,发酵温度为30~ 34℃时,较适于GABA的生成,此时发酵液中GABA含量可达4g/L以上;振荡培养(100r/ min)和静置培养对GABA的产生影响不大。

利用微生物发酵生产GABA是一种安全,低成本的方法。乳酸菌在食品工业中属食品级微生物,基本上不存在安全卫生方面的问题[3,4,9~11]。因此,可以利用筛选出的乳酸菌进行富含GABA 功能因子食品的研究与开发及GABA的制备。目前日本在研究开发富含GABA食品方面所做的工作最多[2,6,9,12],已开发成功的产品有GABA (Gabaron)茶、GABA的米胚芽、发芽糙米等。我国从食品原料中富集GABA技术的研究还刚刚起步,强化GABA的许多制品还只是一种构想,需做大量的研究工作[13]。利用微生物自然资源,分离筛选新功能的乳酸菌菌株,生产GABA功能性食品配料,也是一种新的尝试。参考文献:

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1期             蒋冬花等:酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选         

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